引物設(shè)計要遵循五條原則

引物是決定PCR結(jié)果的關(guān)鍵，引物設(shè)計在PCR反應(yīng)中極為重要。要保證PCR反應(yīng)能準(zhǔn)確、特異、有效地對模板DNA進行擴增，通常引物設(shè)計要遵循以下幾條原則：

1、引物的長度以15-30bp為宜，一般（G+C）的含量在45-55%，Tm值高于55℃［Tm=4(G+C)+2(A+T)］。應(yīng)盡量避免數(shù)個嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列，堿基的分布應(yīng)表現(xiàn)出是隨機的。

2、引物的3’端不應(yīng)與引物內(nèi)部有互補，避免引物內(nèi)部形成二級結(jié)構(gòu)，兩個引物在3’端不應(yīng)出現(xiàn)同源性，以免形成引物二聚體。3’端末位堿基在很大程度上影響著Taq酶的延伸效率。兩條引物間配對堿基數(shù)少于5個，引物自身配對若形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖的堿基對數(shù)不能超過3個由于影響引物設(shè)計的因素比較多，現(xiàn)常常利用計算機輔助設(shè)計。

3、人工合成的寡聚核苷酸引物需經(jīng)PAGE或離子交換HPLC進行純化。

4、引物濃度不宜偏高，濃度過高有兩個弊端：一是容易形成引物二聚體（primer-dimer），二是當(dāng)擴增微量靶序列并且起始材料又比較粗時，容易產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。一般說來，用低濃度引物不僅經(jīng)濟，而且反應(yīng)特異性也較好。一般用0.25-0.5pM/μl較好。

5、 引物一般用TE配制成較高濃度的母液（約100μM），保存于-20℃。使用前取出其中一部分用ddH2O配制成10μM或20μM的工作液。